Офис: 8(812)640-44-50, 8(800)234-88-92 Склад (отгрузка): 8(812)495-63-43  Эл.почта: info@rosmedbio.ru 

Разделы каталога

Наименование
Набор реагентов для выделения плазмидной ДНК GeneJet™ Maxi
Артикул Производитель Единица продажи
K0492
Thermo Fisher Scientific 25
экспер/упак
Цена Корзина
Под заказ




Набор реагентов для выделения плазмидной ДНК GeneJET™ Maxi обеспечивает получение большого количества плазмидной ДНК высокой степени чистоты из культур клеток E. coli. Важнейшим компонентом набора являются микроколонки с уникальной мембраной на силикагелевой основе, протекание жидкости через которую обеспечивается центрифугированием (спин-колонки) или фильтрованием под вакуумом. Набор позволяет получить до 750 мкг высококопийной плазмидной ДНК.  

Условия хранения и использования набора:
Реагент для связывания эндотоксинов следует хранить при +4 °С. Остальные компоненты набора для выделения плазмидной ДНК GeneJET™ Maxi могут находиться при комнатной температуре (15-25 °С). Для более длительного хранения колонок рекомендуется использовать +4 °С. Если в процессе хранения в растворах выпадает осадок, то их следует прогреть при 37 °С. Перед применением растворы охладить до 25 °С. Рибонуклеаза А до вскрытия пробирки может храниться при комнатной температуре. После первого использования пробирку с ферментом следует поместить в морозильную камеру с температурой -20 °С. Раствор для ресуспендирования бактериальных клеток после добавления в него рибонуклеазы А нужно хранить при +4 °С и использовать в течение 6 месяцев.

Внимание! Раствор для щелочного лизиса клеток и концентрированный раствор I для промывки плазмидной ДНК, адсорбированной на мембране, содержат вещества, вызывающие раздражение кожи. Работать с ними необходимо в перчатках.
Пакет со спин-колонками рекомендуется тщательно закрывать после каждого использования.

Принцип «работы» набора:

Осажденные бактериальные клетки ресуспендируют и подвергают щелочному лизису в присутствии додецилсульфата натрия для высвобождения плазмидной ДНК. Полученный лизат нейтрализуют для восстановления вторичной структуры денатурированной плазмидной ДНК, находящейся в растворе. Клеточный дебрис, представляющий собой белки и хромосомную ДНК, а также додецилсульфат натрия остаются в осадке, который удаляют в центрифугированием. Раствор, содержащий плазмидную ДНК, наносят на спин-колонку GeneJET™. Высокая ионная сила раствора лизата создает необходимые условия для связывания плазмидной ДНК с силикагелевой мембраной колонки. Мембрану с адсорбированной на ней ДНК промывают для удаления примесей. Очищенную плазмиду элюируют буфером и хранят при -20 °С. Оптимальный объем клеточной культуры, используемой на начальном этапе, и реальное количество выделяемой ДНК зависит от среды, применяемой для роста клеточной культуры, и количества копий плазмиды. Ночную культуру рекомендуется растить в среде LB (Лурия-Бертани) до оптической плотности раствора A600 = 2-3. Как правило, и для выделения высококопийных плазмид (сконструированных на основе векторов pUC, pBluescript, pGEM, pTZ, pJET) и для выделения низкокопийных плазмид (сконструированных на основе векторов pBR322, pACYC, pSC101) достаточно использовать 250 мл культуры клеток E. coli (штаммы DH10B, DH5альфа, XL1-Blue, JM109, JM107, TOP10 и др.). Максимальный объем культуры (Vмакс), который можно использовать для выделения плазмидной ДНК с помощью набора GeneJET™ Maxi, рассчитывается по фомуле: Vмакс (мл) = 750/A600.

Для выделения плазмидной ДНК с помощью набора реагентов GeneJET™ Maxi предлагается использовать один из трех протоколов. Протокол А предполагает применение низкоскоростного центрифугирования (до 5000 g), протокол B – высокоскоростного центрифугирования (до 48000 g), протокол С – фильтрования под вакуумом. Выделенная ДНК без дополнительной очистки может быть использована в молекулярно-биологических экспериментах, таких как гидролиз эндонуклеазами рестрикции, полимеразная цепная реакция, транскрипция in vitro, трансформация и трансфекция в клетки, анализ на автоматическом секвенаторе.

Достоинства метода:

Эффективность – высокий выход очищенной плазмидной ДНК (до 750 мкг из примерно 250 мл бактериальной культуры).
Высокая концентрация очищенной плазмидной ДНК – более 400 нг/мкл.
Скорость – вся процедура занимает 60 мин, что существенно быстрее по сравнению с колоночной хроматографией низкого давления.
Удобство – не требуется экстракция белков смесью фенол/хлороформ или осаждение ДНК спиртом; используются спин-колонки, центрифугирование или фильтрование под вакуумом.
Выделенная ДНК готова к последующему использованию.